Демонстрация активности собственных ионных каналов вирусно-кодируемых белков
В данном обзоре обобщены типы доказательств, которые могут быть использованы для демонстрации того, что вирусный белок обладает активностью ионных каналов, присущей жизненному циклу вируса. Предполагается, что активность ионных каналов является ключевым этапом жизненного цикла вируса гриппа, а белок, ответственный за эту активность, – это белок М2, кодируемый вирусом. В данном обзоре сопоставляются данные, подтверждающие вывод о том, что белок A/M2 вируса гриппа А обладает активностью ионных каналов, с данными о том, что белок 3AB, кодируемый риновирусом человека, обладает активностью ионных каналов.
1 Введение
Если предполагается, что белок, кодируемый в клетке, функционирует как ионный канал в определённом типе клеток, можно записать сигнал непосредственно из этой клетки, изменить условия записи, изменить экспрессию генов в этом типе клеток и сделать относительно простые выводы о возможности функционирования рассматриваемого белка как ионного канала или субъединицы комплекса ионных каналов. Однако для белков ионных каналов, кодируемых вирусами, ситуация сложнее, поскольку они часто кодируют белки, для которых не существует известных гомологов, и поскольку белок, кодируемый в клетке, может функционировать как в самой вирусной частице (вирионе), так и в инфицированной клетке, и, что ещё больше усложняет анализ, он может активировать эндогенный клеточный ионный канал, который в норме неактивен.
Электрическая активность была зарегистрирована для нескольких белков, кодируемых вирусами: NB вируса гриппа B [ 1 ] , VPU вируса иммунодефицита человека [ 2 ] , белок A/M2 вируса гриппа A [ 3 ] , белок BM2 вируса гриппа B [ 4 ] и белок канала K + вируса хлореллы [ 5 ] , и для некоторых из этих белков было сделано заявление, что эти белки служат для обеспечения активности ионного канала, которая необходима на определенном этапе жизненного цикла вируса. Целью этого обзора является оценка типа доказательств, которые могут быть использованы для демонстрации внутренней активности ионного канала белка, в частности для белков, кодируемых вирусами. В этом обзоре мы будем отличать ионный канал от поры по критериям, что ионные каналы являются как селективными для ограниченного диапазона ионов, так и обладают свойством быть закрытыми до тех пор, пока они не будут активированы химическим или электрическим стимулом.
Основным экспериментальным препятствием для демонстрации активности ионных каналов вирусно-кодируемых белков является сложность регистрации активности ионных каналов от чрезвычайно малых вирусов или внутриклеточных органелл, содержащих предполагаемые белки ионных каналов. Даже если бы была возможность регистрации от этих структур или инфицированных клеток, все равно было бы необходимо отличать активность ионных каналов вирусно-кодируемого белка от активности ионных каналов белков клетки-хозяина. Вместо регистрации от вируса, органеллы или клетки-хозяина, свойства предполагаемых белков ионных каналов изучались в системах экспрессии, и эти свойства сравнивались с ожидаемыми от жизненного цикла вируса на соответствующей стадии, предложенной для белка. Чем больше число корреляций, которые можно установить между функцией ионного канала, предсказанной из биологической роли, и фактической функцией ионного канала в системе экспрессии, тем сильнее можно доказать внутреннюю активность ионных каналов. В этом обзоре будут приведены два примера вирусно-кодируемых белков: белок A/M2 вируса гриппа и белок 3AB риновируса, сопоставляющие доказательства того, что каждый из них служит ионным каналом в жизненном цикле вируса.
2 Белок A/M2 вируса гриппа
Дело в том, что внутренняя активность ионного канала играет важную роль в жизненном цикле вируса, пожалуй, наиболее убедительно доказывается для белка A/M2 вируса гриппа A, поскольку этот канал изучался в течение некоторого времени, и, как оказалось, противовирусное соединение амантадин действует, ингибируя активность ионного канала. Вирион гриппа A ограничен мембраной, образованной путем отпочкования от плазматической мембраны инфицированной клетки, и содержит три интегральных мембранных белка: гемагглютинин (ГА), нейраминидазу и A/M2 (обзор в [ 6 ] ). Доказательства того, что белок A/M2 обладает внутренней активностью ионного канала, получены не только из измерений его активности ионного канала в системах экспрессии, но и из измерений на мутантных белках A/M2, детального знания жизненного цикла вируса и экспериментов с использованием противовирусного препарата амантадина (см. Рис. 1А ).
HA вируса гриппа А связывается с рецептором сиаловой кислоты на поверхности мембраны инфицированной клетки, а затем подвергается эндоцитозу (обзор в [ 6 ] ). Находясь в кислой эндосоме, белок HA претерпевает конформационные изменения в свою форму с низким pH, что обнажает гидрофобный пептид слияния, и после слияния внутренняя часть вируса подвергается воздействию цитоплазмы инфицированной клетки. Однако одного слияния недостаточно для высвобождения вирусного генетического материала (раздевания), поскольку рибонуклеарные белки (РНП) высвобождаются из белка матрикса (М) только при низком pH [ 7 ] . По этой причине для раздевания необходим этап низкого pH. Несколько линий доказательств указали на белок A/M2, как на ответственный за это закисление, и привели к постулату, что белок A/M2 может обладать активностью ионного канала [ 8 , 9 ] . Было высказано предположение, что эта активность ионного канала вызывает закисление вириона, пока он находится внутри кислой эндосомы, и, предположительно, продолжает обеспечивать закисление после начала процесса слияния, чтобы поддерживать низкие условия pH, необходимые для полного высвобождения РНП из белка М (см. рис. 1А , шаги 3 и 4).
Первая линия доказательств, указывающих на участие белка A/M2 в закислении вириона, была получена из экспериментов с амантадином, который ингибирует «ранний» этап раздевания при репликации; эти данные были рассмотрены [ 10 , 11 ] . Амантадин-резистентные «ускользающие» мутантные вирусы содержат изменения аминокислот в трансмембранном (ТМ) домене белка A/M2 [ 12 ] , что позволяет предположить, что ингибирующая молекула и белок A/M2 каким-то образом взаимодействуют. Представление о том, что белок A/M2 обладает активностью ионного канала или способен осуществлять закисление, пришло из экспериментов, в которых изучалась «поздняя» фаза инфекционного цикла, в которой белок HA транспортируется из эндоплазматического ретикулума на поверхность инфицированных клеток ( рис. 1A , этап 6). Было известно, что белок HA некоторых штаммов гриппа встраивается в клеточную мембрану в своей конформационной форме с низким pH, когда инфицированные клетки подвергаются воздействию микромолярных концентраций амантадина [ 8 ] , предположительно из-за низкого pH транс - сети Гольджи [ 13-15 ] . Когда ионофор монензин, который катализирует обмен Na + на H + через мембраны, был добавлен к инфицированным клеткам, обработанным амантадином, HA встраивался в плазматическую мембрану в своей форме с высоким pH, что позволяет предположить, что белок A/ M2 и монензин [ 8 , 15 ] оба действуют, шунтируя градиент pH через мембрану Гольджи.
Белок ионного канала A/M2 представляет собой гомотетрамерный интегральный мембранный белок, в котором каждая цепь зрелого белка содержит 96 аминокислотных остатков [ 9 , 16–22 ] . Кодирующие области белка A/M2 сохранились во всех известных штаммах вирусов гриппа А птиц, свиней, лошадей и человека, а аминокислотная последовательность домена TM белка A/M2 сохранилась в большей степени, чем остальная часть белка [ 23 ] . Домен TM состоит из 19 остатков и содержит как полярные остатки, так и остаток гистидина, что позволяет домену TM белка A/M2 составлять белковое ядро (пору канала), которое обеспечивает поток протонов через мембрану.
Прямые доказательства того, что белок A/M2 имеет активность ионного канала, были получены при регистрации данных из ооцитов Xenopus laevis [ 3 ] и клеток млекопитающих [24-26 ] , которые экспрессировали этот белок. Было обнаружено , что ооциты имеют активность ионного канала, которая увеличивалась при снижении pH раствора, омывающего N-концевой эктодомен белка [24, 27-29]. Эта активность настолько сильна, что ооциты и клетки млекопитающих могут закисляться за короткое время [26, 30 ] при погружении в слабокислый раствор . Активность ионного канала и закисление ингибировались амантадином в микромолярных концентрациях [ 31 ] . Однако эти результаты, хотя и согласуются с внутренней активностью ионного канала, не были достаточными для демонстрации того, что активность была присуща белку A/M2, а не просто результатом активации обычно молчащего эндогенного белка экспрессирующей клетки. Два дополнительных доказательства подтверждают этот вывод. Во-первых, мутации, внесенные в домен TM белка A/M2, вызывают изменения в функциональных характеристиках белка, которые предсказаны из биологии вирусной инфекции или ожидаемых свойств домена TM. Белки A/M2 с мутациями, соответствующими обнаруженным в амантадин-резистентных вирусах-мутантах, обладают активностью ионного канала, экспрессируемой в ооцитах, которая устойчива к амантадину [ 27 , 32 ] . Во-вторых, мутации двух аминокислот в домене TM белка вызывают отчетливые изменения в свойствах обработки протонов регистрируемой активности. Белки, в которых His 37 был мутирован в Gly, Ala или Glu, обладают активностью ионного канала, отличной от таковой белка дикого типа (wt), тем, что их активность неспецифична для протонов и относительно независима от pH раствора, омывающего N-концевой эктодомен, чем белок wt [ 28 ] . Мутантные белки A/M2, у которых Trp 41 мутирован в Ala, Cys, Phe или Tyr, активируются при более высоких значениях pH, чем белок дикого типа, и способны поддерживать отток протонов во внешнюю среду с высоким pH, в отличие от белка дикого типа, который «захватывает» протоны в цитоплазме [ 33 ] . Кроме того, очищенный рекомбинантный белок A/M2 при введении в искусственные липидные бислои или везикулы вызывает активность ионных каналов, чувствительную к амантадину [ 34 , 35 ].и селективен к протонам [ 35 ] . Эти результаты, взятые вместе, показывают, что белок A/M2 обладает необходимой активностью ионного канала в системах экспрессии, что объясняет его предполагаемую роль в снятии вирусной оболочки.
Важно отметить, что ни одно доказательство не будет достаточным для вывода о том, что белок A/M2 обладает собственной активностью ионного канала. Например, активность, зарегистрированная в искусственных липидных бислоях, может не отражать активность, обнаруженную в вирусе или инфицированной клетке. Активность, зарегистрированная в ооцитах от белка wt A/M2, может быть результатом повышения регуляции эндогенного ионного канала, как в случае с другими вирусно-кодируемыми белками [ 36 ] . Однако совокупность доказательств, полученных в результате регистрации активности ионного канала, и знание жизненного цикла вируса и предполагаемой роли белка, вместе с результатами экспериментов с ингибитором амантадином и мутациями, устойчивыми к амантадину, помогают убедительно доказать наличие собственной активности ионного канала. Недавно этот аргумент в пользу белка A/M2 был подкреплен открытием, что белок B/M2 вируса гриппа B является интегральным мембранным белком [ 4 ] , обладающим активностью ионного канала [ 37 ] .
Следует отметить, что со временем наступают изменения морфологических и функциональных свойств клеток, когда они экспрессируют большие количества белка A/M2. Клетки, сверхэкспрессирующие белок A/M2, демонстрируют расширение просвета аппарата Гольджи и задержку транспорта по секреторному пути, которые улучшаются амантадином и имитируются обработкой ионофором монензином [ 38 ] . Кроме того, мы заметили, что клетки, сверхэкспрессирующие белок A/M2, также демонстрируют большее количество неспецифического тока «утечки» (который не чувствителен к амантадину) при исследовании методом патч-клампа (клетки млекопитающих) или методом двухэлектродного зажима напряжения (ооциты), чем контрольные клетки, не экспрессирующие белок. Амплитуда этих токов утечки часто превышала амплитуду тока, чувствительного к амантадину, после экспрессии белка A/M2 в течение нескольких дней. Таким образом, были обнаружены вторичные эффекты, обусловленные присутствием белка A/M2, и эти эффекты являются следствием его внутренней активности. Эти вторичные эффекты приводят к общему повышению «проницаемости» экспрессирующих клеток, и было бы неверно делать вывод о том, что это повышение «проницаемости» клеток, экспрессирующих белок A/M2, является внутренним свойством этого белка.
3 Белок 3AB человеческого риновируса
В отличие от мембраносвязанного вируса гриппа, человеческий риновирус (HRV), пикорнавирус, ограничен эйкосаэдрическим белковым капсидом. Вместо того, чтобы отпочковываться от плазматической мембраны, как это делает вирус гриппа, сборка риновируса происходит через связанные с мембраной репликационные комплексы внутри инфицированной клетки (см. Рис. 1B ). Репликация человеческого риновируса требует белкового комплекса 3AB, который происходит из длинной полипептидной цепи, кодируемой вирусной мРНК. Полипептид расщепляется тремя вирусными протеазами (включая 2A и 3C) с образованием 11 белковых продуктов из трех полипептидных областей. Третья область, P3, кодирует четыре неструктурных белка (не обнаруженных в вирионе): 3A, 3B, 3C и 3D pol . Цис - действующий репликативный элемент действует как первичная матрица для уридилирования 3D pol VPg (3B), который ковалентно связан со всеми вновь синтезированными вирусными положительными и отрицательными цепями РНК и с зарождающимися цепями промежуточной репликационной РНК [ 39 ] . VPg (3B) передается репликационному комплексу белком-предшественником 3AB [ 40 ] , который также взаимодействует с 3D pol и, скорее всего, привязывает 3D pol к комплексу мембраны репликации [ 41 ] . Область 3A белка 3AB содержит консервативную гидрофобную область из 22 аминокислот [ 42 ] и, как полагают, участвует в секвестрации вирусных белков, необходимых для формирования и функционирования репликационного комплекса [ 43 ] . Мутанты, ускользнувшие от противовирусного бензимидазольного препарата, энвироксима, локализуются в области 3A белка 3AB [ 43 ] . Поскольку эта часть 3AB ассоциируется с мембраной, а экспрессия белка 3AB, как было показано, изменяет проницаемость плазматической мембраны клеток, экспрессирующих этот белок [ 44 , 45 ] , мы рассмотрели возможность того, что белок 3AB может обладать активностью ионного канала, а энвироксим может функционировать подобно амантадину, возможно, ингибируя активность ионного канала.
3.1 Белок 3AB и возможная активность ионного канала
Экспрессия белка 3AB в Escherichia coli приводит к тому, что бактериальная клетка становится более проницаемой для нескольких малых молекул [ 44 ] , а клетки , инфицированные полиовирусом, как было показано, более проницаемы для одновалентных катионов и малых молекул, чем неинфицированные клетки [ 46-48 ] . Мы попытались проверить возможную активность ионных каналов белка 3AB, экспрессируя белок в ооцитах X. laevis , но обнаружили, что после инъекции мРНК, кодирующей белок 3AB, произошла активация эндогенного клеточного белка; этот тип активации был обнаружен и для других вирусно-кодируемых белков [ 49 ] . По этой причине мы использовали другой подход для проверки активности ионных каналов, связанных с белком 3AB. Этот подход заключается в очистке белка, включении его в плоские липидные бислои и проверке этих бислоев на активность ионных каналов.
Везикулы, содержащие белок 3AB, были включены в липидные бислои с использованием техники нистатин-эргостерол, которая позволяет количественно определить количество везикул, включенных в бислой до появления активности ионного канала (см. [ 50 ] ). Вкратце, очищенный белок 3AB, 1 мкг/мкл, был включен в искусственные везикулы с использованием техники замораживания/оттаивания/ультразвуковой обработки. Везикулы состояли из фосфатидилэтаноламина:фосфатидилхолина:фосфатидилсерина:эргостерола в весовом соотношении 2,1:0,9:1:1 с 0,05 мкг/мкл нистатина. Эти везикулы были слиты с плоским липидным бислоем диаметром 200–400 мкм.
Электрическая активность наблюдалась в виде множественных состояний проводимости, для которых ток переносился катионами довольно неселективно. Пример трех основных состояний проводимости: проводимость средней амплитуды (80 пСм ± 1 пСм SEM; n = 6), состояние медленной стробирующей субпроводимости (29 пСм ± 5 пСм SEM; n = 6) и состояние полной проводимости (103 пСм ± 8 пСм SEM; n = 6), характеризующееся быстрым стробированием, были обнаружены [ 51 ] . В дополнение к этим трем состояниям проводимости также наблюдались спорадически возникающее состояние большой проводимости (до 1 нСм) и состояния средней проводимости, которые были сильно зависимы от напряжения при изучении в асимметричных одновалентных солевых растворах ( Рис. 2 ) [ 51 ] . Эта электрическая активность была значительно снижена кипячением белка перед включением в липидные везикулы. Однако ни одна из электрических активностей не была значительно ингибирована противовирусным энвироксимом.
Чтобы определить, достаточна ли электрическая активность, наблюдаемая в бислоях, чтобы сделать мембрану проницаемой для крупных молекул, белок 3AB был включен в везикулы, содержащие флуоресцентно меченые декстраны (FITC-декстран) различных размеров. Был количественно определен отток декстранов из этих везикул. Мы обнаружили, что FITC-декстран с молекулярной массой до 70 000 Да был способен выходить из везикул, содержащих 3AB, но не из контрольных везикул ( рис. 3 ). Результаты этого эксперимента согласуются с большими (1 нСм) проводящими состояниями, наблюдаемыми для активности ионного канала, связанного с белком 3AB. Однако отток также не был значительно ингибирован энвироксимом.
Активность ионных каналов грубых репликативных комплексов . Поскольку белок 3AB обнаруживается в репликационном комплексе в инфицированных вирусом клетках [ 52 ] , мы протестировали репликационные комплексы HRV-14 на активность ионных каналов. Для этого мы включили грубые репликационные комплексы в плоские липидные бислои. Мы обнаружили, что репликационный комплекс также демонстрировал активность ионных каналов при включении в плоские липидные бислои ( рис. 4 ). Активность ионного канала репликационного комплекса была аналогична активности белка 3AB в двух отношениях. Во-первых, оба канала были довольно неселективны к различным ионам с предпочтением Na>K. Во-вторых, оба продемонстрировали слабую чувствительность к pH, причем оба показали снижение проводимости при снижении pH. Каналы также различались по нескольким параметрам. Активность ионного канала, связанная с репликационным комплексом, имела более длительное время открытия с большим первичным состоянием проводимости 313 пСм (±10 пСм SEM; n = 3), чем связанная с белком 3AB [ 51 ] . Активность ионного канала, связанного с белком 3AB, также имела больше состояний проводимости, чем активность репликативного комплекса.
3.2 3AB канал или 3AB пора?
Представленные выше результаты продемонстрировали, что белок 3AB способен проявлять электрическую активность в бислоях и обеспечивает утечку декстранов из везикул. Оставался вопрос, действует ли белок как ионный канал или как пора. Чтобы ответить на этот вопрос, мы определили количество белка 3AB, связанного с бислоем, обладающим электрической активностью. Это было сделано путем подсчета количества везикул, включенных в мембрану до того, как была обнаружена электрическая активность 3AB, и последующего умножения количества везикул на среднее содержание белка 3AB в везикуле для получения количества молекул 3AB, включенных в бислой.
Встраивание везикул определялось путём подсчёта количества транзиентных токов, вызванных нистатином и эргостеролом («шипов слияния»), которые возникали через бислой. Эти токи являются транзиентными, поскольку эргостерол, необходимый для образования нистатиновых каналов, диффундирует в липиды бислоя, свободного от эргостерола, после встраивания везикулы.
Анализ аминокислот использовался совместно с анализом пиков слияния для вычисления количества молекул белка 3AB на наблюдаемую электрическую активность канала. Это было сделано путем измерения количества белка 3AB, включенного в везикулы из известной концентрации белка. Мы обнаружили, что среднее количество молекул белка 3AB на везикулу зависит от pH, при котором образовались везикулы. При pH 7,2 мы подсчитали, что среднее количество молекул 3AB на активность канала составляло 323±14. Мы наблюдали, что в среднем четыре события слияния происходили до того, как наблюдалась активность ионного канала. Доля молекул, которые фактически участвовали в активности, подобной ионному каналу, которую мы наблюдали, неизвестна, но среднее количество молекул на активность слишком велико, чтобы убедительно утверждать, что электрическая активность была результатом ионного канала [ 53 - 55 ] .
Сравнение данных о наличии у белков 3AB и A/M2 собственной активности ионного канала является информативным. Биологические доказательства, указывающие на необходимость ионного канала для обеспечения закисления вириона гриппа, убедительны, однако биологические доказательства, указывающие на необходимость активности ионного канала в течение жизненного цикла риновируса, не столь убедительны. Доказательства наличия белка A/M2 включают необходимость закисляющей активности для снятия вирусной оболочки и связь белка A/M2 с закисляющей активностью. С другой стороны, подозрение о том, что белок 3AB может быть ионным каналом, основывалось лишь на предположении о необходимости ионного канала или поры в репликативном комплексе на этапе сборки жизненного цикла. Биофизические доказательства того, что белок A/M2 обладает собственной активностью ионного канала, подтверждаются многочисленными результатами: экспериментами, в которых эта активность регистрировалась в различных типах клеток, корреляцией чувствительности активности ионного канала мутантных белков к амантадину с чувствительностью к амантадину вируса, экспрессирующего эти мутантные белки, и обнаружением активности ионного канала в очищенном белке A/M2. Напротив, биофизические доказательства того, что белок 3AB образует ионный канал во время репликации, слабы. Во-первых, его возможная активность ионного канала не может быть изучена в одной из наиболее полезных систем экспрессии – ооците шпорцевой лягушки (Xenopus ), поскольку повышение активности эндогенного канала ооцита следует за инъекцией мРНК, кодирующей белок 3AB. Во-вторых, для измерения активности электрического канала в бислоях требуется введение нескольких сотен молекул 3AB (хотя эта цифра является верхним пределом), и эта активность не ингибируется энвироксимом в значительной степени. В-третьих, повышенная проницаемость плазматической мембраны клеток, экспрессирующих белок 3AB, может отражать тот же феномен, что и у клеток, экспрессирующих белок A/M2 в течение некоторого времени: состояние клетки может быть подвержено влиянию экспрессии вирусного белка таким образом, что проницаемость увеличивается. Высвобождение вириона риновируса из инфицированной клетки необходимо для репликации, но этот этап может быть достигнут либо путём лизиса клетки, либо с помощью липидной поры, не требующей ионной специфичности канала A/M2.
4 Заключение
Сравнение
доказательств того, что эти два белка обладают собственной активностью
ионных каналов, показывает, что для подтверждения этой активности
требуется совокупность многочисленных данных, полученных из биологии
вируса и биофизических измерений. Ни одно из доказательств в отдельности
не может быть достаточным для убедительного обоснования.
Комментарии
Отправить комментарий